Western Blot 全流程：从提蛋白到显影
这项技术是干什么的
Western Blot（蛋白免疫印迹，简称 WB）回答的是一个很直接的问题：我的样品里有没有某个蛋白？有多少？它是生物医学实验室出镜率最高的实验之一——验证基因敲除是否成功、看药物处理后某个蛋白的表达变化、检测信号通路激活（磷酸化），都离不开它。本组目前主要用它检测 MLE-12 细胞（山奈酚预处理后 erastin 或 LPS 诱导）中的铁死亡相关蛋白（GPX4、SLC7A11、ACSL4 等，课题背景见 课题总览）。
一句话概括原理：先把样品里的蛋白按分子量大小用电泳分开，再把这些蛋白「印」到一张膜上，然后用抗体像探针一样去特异性识别你要的那个蛋白，最后通过化学反应发光显影，成为一条肉眼可见的「条带」。
目的蛋白：你想检测的那个蛋白；内参蛋白：每个细胞都稳定大量表达的蛋白（如 β-actin、GAPDH），用来证明「每个孔上样量一样」；抗体：识别工具，一抗认目的蛋白，二抗认一抗并带着发光的「灯泡」（HRP 酶）。
基本原理
转膜之后，膜上「平铺」着所有蛋白。检测就像叠罗汉：一抗特异性结合目的蛋白 → 带有 HRP（辣根过氧化物酶）的二抗结合一抗 → 加入 ECL 底物后 HRP 催化反应发光 → 胶片或成像仪捕捉光信号。
完整流程总览
整个实验从收细胞到出结果一般需要 2~3 天（其中一抗孵育过夜占一晚）。先建立整体地图，再逐步细看：
分步详解与关键参数（本组标准流程）
下面各步的参数均为本组实际操作标准：与文献或试剂说明书不一致时，组内一律按这里的来（不同实验室条件不同，我们组按此标准操作）。
1. 裂解提蛋白：快、冷、加抑制剂
裂解液用 RIPA（含蛋白酶抑制剂；测磷酸化蛋白再加磷酸酶抑制剂），全程冰上操作。组织、细胞两条路线：
- 组织：称重后置冰上，每 20 mg 组织加 100 μL RIPA 裂解液，剪碎，组织破碎仪充分破碎，冰上静置 30 min；
- 细胞：直接加 RIPA 裂解，冰上静置 10 min；
- 离心与保存：4 ℃、12000 rpm 离心 10 min，取上清装入离心管，-80 ℃ 保存；
- 为什么全程冰上：蛋白在室温下会被样品自带的蛋白酶降解。
- 为什么测磷酸化必须加磷酸酶抑制剂：否则磷酸基团会被迅速水解，p-蛋白条带消失。
2. BCA 定量：让每个孔「起点公平」
本组按 BCA 试剂盒做标准曲线定量，操作如下：
- 工作液按试剂盒说明 A:B = 50:1 配制，充分混匀；
- 标准品与样品各 20 μL 加入 96 孔板（样品有限时可各取 10 μL，保持样品:工作液 = 1:20）；
- 每孔加 200 μL 工作液，振荡器震荡 15 s 混匀；
- 封板 37 ℃ 孵育 30 min，冷却至室温后测 562 nm 吸光值，做标准曲线计算浓度。
算出浓度后把所有样品用裂解液调到同一浓度，再统一加入 5×Loading Buffer（终浓度 1×）。
本组每孔上样 20 μg 总蛋白。先把所有样品调到同一浓度，后面只加同体积就能保证上样量一致——这是内参条带齐不齐的前提。
3. 变性与上样
样品加上样缓冲液后 100 ℃ 煮 5 min 变性，瞬时离心把挂壁液体甩下来（个别易聚合的跨膜蛋白才用 70 ℃ 10 分钟的温和条件，常规样品一律按 100 ℃ 走）。上样按含 20 μg 蛋白的体积计算，最左孔加 5 μL marker；记好上样顺序图，建议用排枪或记号笔在膜上做角标。
4. 配胶与电泳：电压与凝胶浓度的选择
配胶：按目的蛋白分子量选分离胶浓度，配方按试剂说明书配制；浓缩胶统一 5%。玻璃板清水洗净晾干；灌分离胶至合适高度后加一层无水乙醇液封，待其凝固后倒掉乙醇，再灌浓缩胶、插梳子。凝胶浓度决定分离范围：
| 目的蛋白分子量 | 推荐分离胶浓度 | 说明 |
|---|---|---|
| 10~30 kDa（小） | 12%~15% | 胶越浓，小蛋白分得越开 |
| 30~120 kDa（大多数） | 10%~12% | 常用默认选择 |
| 120~300 kDa（大） | 6%~8% | 大蛋白用低浓度胶，转膜时间也要延长 |
电泳：80 V 约 30 min（浓缩胶，让样品「排齐」），样品进入分离胶后调 120 V 约 90 min（恒压），跑至染料前沿接近底部。
5. 转膜：方向别搞反
PVDF 膜先在甲醇中活化 2 min（NC 膜不用），再在转膜缓冲液中平衡。按本组口诀组装「转膜三明治」：海绵-滤纸-黑（胶）-白（膜）-滤纸-海绵；叠好后在胶上做标记，防止膜的反正面搞错。
本组湿转条件：300 mA 恒流、冰上 120 min，并按目的蛋白分子量调整转膜条件、胶浓度与胶厚度（不同实验室条件不同，我们组按此标准）。小分子蛋白（<30 kDa）注意别转过头（可用 0.2 μm 膜、缩短时间）；大分子蛋白（>150 kDa）适当延长转膜时间。
6. 封闭与抗体孵育
- 封闭：5% 脱脂奶粉（TBST 配制）。转膜结束先用 TBST 洗 5 min，再室温摇床封闭 1 h。注意：检测磷酸化蛋白建议改用 5% BSA，奶粉中的酪蛋白可能有磷酸化类似物导致背景。
- 一抗：用 5% 脱脂奶粉稀释，比例按抗体灵敏度选择（从说明书推荐稀释度起步摸索），4 ℃ 摇床过夜，用量约 4~5 mL。
- 洗一抗：TBST 3 次 × 10 min，洗掉未结合抗体（背景高的元凶多在洗涤不充分）。
- 二抗：5% 脱脂奶粉稀释，比例一般 1:3000，室温摇床 2 h。
- 洗二抗：TBST 3 次 × 5 min。
- 二抗的种属要匹配一抗：一抗是兔源的，就用「羊抗兔-HRP」二抗。
7. ECL 显影
按 ECL A 液:B 液 = 1:1 混匀后加入发光盒，放入 PVDF 膜反应 5 min，直接用数码成像设备显影，扫描保存。选不饱和曝光的图像做定量——过曝的条带「白心」是无法比较灰度的。
膜重复利用：蛋白样品及抗体特别珍贵时，可用 Stripping buffer 洗脱掉已结合的抗体，重新封闭后再孵育下一轮抗体（注意事项见下方组内信息）。
常见问题排查表
| 现象 | 可能原因 | 解决办法 |
|---|---|---|
| 没有条带 | 抗体失效/稀释度不对；转膜失败；蛋白量太低；目的蛋白在该细胞不表达 | 先跑阳性对照裂解液；用丽春红染膜确认转膜成功；查文献确认表达量 |
| 整片高背景 | 封闭不足；洗涤不充分；抗体浓度过高；膜干了 | 延长封闭至 2 小时；增加洗膜次数和时长；抗体稀释 2~5 倍；全程保持膜湿润 |
| 出现多条带 | 蛋白降解；非特异结合；目的蛋白本身有剪切/修饰形式 | 确认抑制剂新鲜；提高封闭液浓度/一抗特异性；查 UniProt 确认异构体大小 |
| 条带拖尾/笑脸 | 上样量过大；电泳过热；样品盐浓度过高 | 减少上样量至 20 μg；降低电压、4 ℃ 电泳；样品透析或控制裂解液体积 |
| 内参不齐 | 定量不准；上样误差；边缘孔蒸发 | 重新定量；用排枪上样；尽量不用最边缘的孔 |
| 条带发白（反白） | 曝光过度或抗体过量 | 缩短曝光时间、稀释抗体，选线性范围内的图像 |
结果怎么看
拿到膜图后第一步看三件事：① Marker 位置——条带出现的分子量是否与目的蛋白理论值一致；② 内参是否齐——不齐则上样有问题，需重跑；③ 条带形状是否清晰锐利。定量时用 ImageJ 等软件做灰度分析：目的蛋白灰度 ÷ 内参灰度 = 校正后表达量，再在组间比较。
严谨性红线（务必阅读）
- 不允许把不同膜/不同次实验的条带拼在同一张图里而不加任何说明（如裁剪拼接必须注明，并用分隔线标出）；
- 不允许对目的蛋白和内参进行不对称的对比度/灰度调整来「美化」定量结果；
- 不允许裁掉与研究结论不符的条带，或选择性展示重复次数不足的结果；
- 原始膜图（含全膜扫描）和未处理的成像文件必须完整归档保存，投稿和答辩都可能被要求提供；
- 定量比较应基于≥3 次独立重复，用统计检验，而不是「挑一张好看的」。
组内信息
- 样品背景：MLE-12 细胞，山奈酚预处理后加 erastin 或 LPS 诱导（课题见 课题总览）
- 拟检测指标：铁死亡相关蛋白（GPX4、SLC7A11、ACSL4 等，详见 铁死亡一篇的检测指标表），具体抗体清单待定——确定后把公司、货号与稀释比例补在这里
- 内参：β-actin / GAPDH（视目的蛋白分子量选择错开的内参）
- ECL 与成像设备：ECL 试剂的存放位置、数码成像设备所在房间及使用登记方式待补充
- Stripping buffer 使用注意：仅在样品或抗体特别珍贵时用于膜重复利用；洗脱后先孵内参确认剥脱干净，再孵下一轮抗体；同一张膜反复洗脱会逐次损失蛋白信号，次数尽量控制在 2~3 次以内
学完之后
建议的下一步：先跟着师兄师姐完整看一次操作（重点看转膜组装和上样），再用成熟的阳性样品（如实验室常规细胞的 β-actin）独立重复一次全流程，确认手上流程跑通后再上自己的样品。检测 RNA 水平请继续阅读 qPCR 教程。