CCK-8 / MTT：细胞增殖与毒性检测

实验技术入门标签：细胞活力 · 药物毒性 · IC50 更新：2026-10-18

这项技术是干什么的

给药处理之后，细胞是死是活？增殖变快还是变慢？这是细胞实验里最基础的功能学问题。CCK-8 与 MTT 就是回答这个问题最常用的两种试剂盒：把试剂加进 96 孔板，孵育后用酶标仪读一个吸光度（OD）值，颜色越深 = 活细胞越多。操作简单、通量高、当天出数据，通常是新人进组后第一个「自己做出数据」的实验。

典型用途：绘制细胞增殖曲线、检测药物处理后的存活率、拟合药物 IC50（半数抑制浓度）、评估某种处理对细胞的毒性。要提醒的是：这类方法测的是「代谢活性」，读数同时受活细胞数目和单个细胞代谢状态影响——所以结论要表述为「相对活力」，而不是直接的「细胞数量」。

📋 一句话记住原理

活细胞线粒体里的脱氢酶能把底物还原成有颜色的产物，死细胞酶活性丧失、不反应——所以颜色深浅 ≈ 活细胞多少。CCK-8 与 MTT 的差别只在「底物和产物长什么样」。

基本原理

两类方法的核心反应相同：底物进入活细胞，被线粒体脱氢酶（依赖 NADH/NADPH）还原成甲臜（formazan）类产物。CCK-8 的底物是 WST-8，产物是水溶性橙黄色甲臜，直接溶在培养基里，加完试剂孵育后就能上机测 450 nm 吸光度；MTT 的产物是不溶于水的紫色甲臜结晶，沉积在细胞内，必须先吸去培养液、加 DMSO（或异丙醇）把结晶溶解出来，再测 570 nm 左右的吸光度。

图 1 CCK-8 / MTT 检测原理：活细胞线粒体脱氢酶还原底物生成甲臜，死细胞不反应，OD 值反映活细胞多少

完整流程总览

以 96 孔板 CCK-8 检测为例，一个完整实验周期 = 铺板贴壁 1 天 + 处理 1~4 天 + 读数半天：

设计板式并接种细胞对数生长期细胞按预摸索的密度接种，每孔 100 μL，画好板式图。

贴壁过夜细胞贴壁伸展、恢复状态后开始处理。

加药处理按分组加入不同浓度药物，记录开始时间。

到达时间点加入 CCK-8每 100 μL 培养基加 10 μL 试剂，轻拍混匀，避免气泡。

孵育显色培养箱内孵育 1~4 小时（预实验确定最佳时间）。

酶标仪读数测 450 nm 吸光度，参比波长 600~650 nm 扣除浑浊干扰。

计算与作图扣除空白，算存活率 / 画增殖曲线 / 拟合 IC50。

MTT 流程多两步：孵育结束后小心吸净培养液 → 每孔加 150 μL 左右 DMSO 振荡溶解结晶，再读 570 nm。其余逻辑完全相同。

分步详解与关键参数

1. 先选方法：CCK-8 与 MTT 的对比

比较项	CCK-8（WST-8 法）	MTT 法
操作步骤	加试剂即可读板，一步到位	需吸液 + DMSO 溶解结晶两步额外操作
产物与波长	水溶性甲臜，450 nm（参比 600~650 nm）	甲臜结晶，DMSO 溶解后 570 nm（参比 630 nm 左右）
灵敏度	通常更高，线性范围更宽	较经典，灵敏度略低
对细胞的毒性	较低，理论上可短时间重复检测	结晶损伤细胞，检测后细胞基本报废
价格	较贵	便宜
首选场景	多数常规活力 / 毒性实验	预算有限或延续组内历史数据时

2. 两种典型实验设计（重点）

设计一：细胞增殖曲线。想知道细胞长多快：按「分组 × 时间点」做矩阵式铺板，时间点通常取 0、24、48、72、96 小时，每个时间点对应一组独立的孔——到点测完这组孔就作废。虽然 CCK-8 毒性低、理论上可以重复测同一孔，但惯例仍是独立孔设计，避免反复开盖与试剂累积对细胞状态的影响。

设计二：药物毒性 IC50。想知道药有多毒：设 6~8 个浓度梯度，按对数（log）间隔设置——如 0、1、3、10、30、100 μM（近似等比），或直接倍比稀释（如 2、4、8……倍）。浓度范围要同时覆盖「几乎无抑制」到「接近全死」，这样拟合出的 S 形曲线才有上下平台。常设 24 / 48 小时两个处理时间分别拟合。

💡 实用技巧

正式实验前先做预实验摸两个东西：① 铺板密度——保证终点时 OD 仍落在「OD 与细胞数成正比」的线性区间（整板读数后用密度梯度找线性段）；② 显色时间——1~4 小时内选一个对照孔 OD 舒适、又不过饱和的时间点。这两个参数定了，后面每批实验都省心。

3. 铺板要点：细节决定复孔质量

细胞状态：取对数生长期、活性好的细胞，接种前充分吹打成单悬液，避免孔间「有的多有的少」。
密度：教科书级典型范围为 96 孔板每孔 3000~10000 个（贴壁细胞，依细胞大小与生长速度调整；以本组 SOP 与预实验为准）。
边缘效应：96 孔板最外圈孔蒸发快、OD 容易漂移。习惯做法是最外圈全部加满无菌 PBS（或培养基），细胞只铺在内圈 60 孔。
复孔与对照孔：每个处理至少 5 个复孔；同时设空白孔（只有培养基 + CCK-8，无细胞），读数时用来扣背景。计算存活率时「对照组」指正常培养、不加药的细胞孔。

⚠️ 注意

如果你的药物本身有颜色或具有还原性（很多植物提取物、纳米材料、抗氧化剂都是），它可能直接显色或还原底物，造成假「活力升高」。必须加设药物背景孔：药物 + 培养基 + CCK-8、无细胞，计算时把这部分背景一并扣除。

4. 读数与计算

酶标仪提前预热，设定 450 nm 检测波长、600~650 nm 参比波长（具体以试剂说明书为准）。读板前检查孔底有无气泡、沉淀与指纹。核心公式：

存活率（%）=（处理组 OD − 空白孔 OD）÷（对照组 OD − 空白孔 OD）× 100%

增殖曲线以时间为横轴、OD（或以 0 时点归一化）为纵轴，画各时间点趋势并标出均值 ± 标准差。IC50 拟合用 GraphPad Prism：浓度取 log 后选 log(inhibitor) vs. response — Variable slope（四参数）模型，报告 IC50 及其 95% 置信区间，不要只报一个孤零零的数字。

常见问题排查表

现象	可能原因	解决办法
OD 值超出线性范围（颜色过深、接近仪器上限）	细胞铺得太多；显色时间过长	降低接种密度或缩短显色时间；对照孔 OD 控制在线性区间内（具体数值以预实验和本组经验为准）
给药组 OD 反而高于对照组	药物本身有颜色或还原性，干扰读数；药物促进代谢而非增殖	增设「药物 + 培养基 + CCK-8」无细胞背景孔扣除；结论表述为「代谢活力」并用独立方法（计数、结晶紫等）验证
复孔间差异大	细胞悬液未吹匀；加样误差；边缘孔蒸发；孔底气泡 / 指纹	接种前充分混匀、用排枪加样；边缘孔加 PBS 防蒸发；读板前擦净板底、去除气泡
OD 整体偏低	细胞量太少；显色时间不足；试剂失效或漏加	提高密度、延长孵育；核查试剂批号与保存条件；设阳性对照孔监控每批试剂
MTT 结晶溶解不完全	吸液后有残留培养基；DMSO 量不足 / 未振荡	小心吸净液体，加足量 DMSO，低速振荡数分钟至紫色均匀再读板

结果怎么看

拿到一批 OD 先做三件事：① 看空白孔——背景应在低位且稳定，忽高说明试剂或培养基有问题；② 看对照组——是否落在线性区间，复孔变异大不大；③ 再看处理组的趋势是否符合预期（如浓度越高 OD 越低的剂量依赖关系）。IC50 结果要结合曲线形态读：数据点有没有铺满上下平台、拟合曲线是否穿过各数据点、95% 置信区间宽不宽——置信区间太宽通常说明浓度梯度没设好或重复不够，应补实验而不是硬报。增殖曲线的结论看整体趋势与时间交互，而不是单个时间点的差异。

严谨性红线（务必阅读）

⛔ 活力 / 毒性数据的学术红线

结论必须基于 ≥3 次独立重复实验（每次独立接种、独立处理），再做统计，不能拿一次实验的复孔冒充独立重复；
不允许随意剔除复孔中「偏高偏低」的数据——除非事先写明剔除规则（如超出均值 ± 2 SD 且能找到物理原因如漏加、气泡），并在论文中如实报告；
IC50 必须报告拟合优度与置信区间，浓度设置需覆盖 0%~100% 抑制范围，否则拟合不可靠；
原始酶标仪导出文件（含所有孔位数据）必须完整归档，不允许事后修改孔位分组对应关系；
药物有颜色 / 还原性干扰时必须设背景扣除孔并在方法学中写明。

组内信息

🏠 本组情况（以当次方案为准）

细胞：MLE-12；药物：山奈酚当前筛选 2 / 5 / 10 μg/mL 三个剂量（母液 1 mg/mL，稀释见药物稀释教程）
实验地点：CCK-8 检测在其他实验室进行，无需预约，凭空闲时间去做（位置师兄师姐会交代）
进度：细胞培养与 CCK-8 细胞活力检测已完成，结果与铺板密度经验值待整理补充

学完之后

建议的下一步：先用一种已有组内历史数据的药物（如顺铂）在你的细胞上重复一次 IC50，和文献 / 组内旧数据对比，确认操作体系没问题，再开展自己的药物。细胞层面的实验练熟后，下一步就该进入整体动物水平——请继续阅读动物实验入门：品系、伦理与基本规范。