免疫组化与免疫荧光（IHC / IF）
这项技术是干什么的
Western Blot 告诉你「样品里有没有这个蛋白、总共多少」，但它把组织磨碎了看，丢失了空间信息。免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）回答的是另一个问题：这个蛋白在组织或细胞里的哪个位置、哪些细胞表达？——这就是「原位（in situ）看见你的蛋白」。
两者的免疫学原理同源：都是用抗体去识别切片上的抗原，差别在「读出方式」：IHC 用连着辣根过氧化物酶（HRP）的二抗催化 DAB 显色，出现棕色沉淀，普通光学显微镜就能看，切片可长期保存；IF 用带荧光基团的二抗，在荧光显微镜 / 激光共聚焦下观察，可以做多色标记与共定位，但荧光会随时间淬灭，需尽快采图。
想知道蛋白「有多少」→ WB / ELISA；想知道蛋白「在哪儿、在哪种细胞」→ IHC / IF；想知道「组织整体形态有没有病变」→ 先做 H.E. 染色。三个问题经常要互相印证。
IHC 与 IF：同源不同读出
两者的核心链条完全一样：切片上的抗原 → 一抗特异性结合 → 带标记的二抗结合一抗 → 显色 / 荧光读出 → 复染衬底 → 镜下观察与拍照。先记住它们的分工差别，后面选路线时不会糊涂：
| 比较项 | IHC（免疫组化） | IF（免疫荧光） |
|---|---|---|
| 显色 / 读出 | HRP 二抗 + DAB，棕色沉淀，普通光镜观察 | 荧光二抗，荧光显微镜 / 共聚焦观察 |
| 多标共定位 | 较难（颜色种类有限，需不同显色系统） | 方便，不同种属一抗 + 不同颜色荧光二抗，2~4 色常见 |
| 信号保存时长 | 切片可长期保存、复查 | 荧光会淬灭，封片后数周~数月内应采图完毕 |
| 仪器门槛 | 普通光学显微镜 | 荧光显微镜；共聚焦更佳（分辨率、断层成像） |
| 适用样本 | 石蜡切片为主，冰冻切片、细胞爬片也可 | 冰冻切片与细胞爬片最常用，石蜡切片亦可（注意自发荧光） |
完整流程总览
以最经典的石蜡切片 IHC 为例，从包埋好的蜡块到镜下读片，一般需要 2 天（其中一抗 4 ℃ 过夜占一晚）：
分步详解与关键参数
1. 样本制备：石蜡、冰冻、爬片三条路
样本制备决定了后续一切。选路线的原则：要形态漂亮、切片能长期保存 → 石蜡；抗原表位敏感、或要做 IF 共定位、或组织含脂肪多 → 冰冻；只看培养细胞 → 爬片。
- 石蜡路线的固定是成败关键：常用 4% 多聚甲醛 / 10% 福尔马林，固定液体积应为组织块的 10~20 倍。固定要「足量但不过度」——固定不足组织自溶、形态垮掉；固定过度（比如泡了好几天）交联过深，抗原表位被「锁死」，后续怎么修复都难救。
- 冰冻路线：OCT 包埋后干冰或液氮速冻，冰冻切片约 6~10 μm，适合抗原表位敏感的抗体和 IF。注意冻融次数，反复冻融会让形态和抗原都变差。
- 细胞爬片：细胞接种在载玻片 / 盖玻片上长到合适密度，直接固定 → 通透 → 染色，是 IF 最常用的样本之一。
2. 抗原修复：把被固定「掩蔽」的表位揭开
甲醛类固定剂在蛋白之间形成交联，会把抗体要识别的表位「遮住」，因此石蜡切片染色前必须做抗原修复。主流是热修复：把切片浸入修复液，微波炉煮沸或高压锅加压热处理十余分钟（具体参数看抗体说明书与本组 SOP）。修复液两种最常用：柠檬酸盐缓冲液 pH 6.0（温和，多数抗体适用）与 EDTA pH 8~9（修复能力强，适合难修复抗原，但可能增加背景）。酶修复（蛋白酶 K 等）现在用得少，一句话记住「对表位敏感的抗原可能更适合温和条件」即可。
不同抗体对修复方式的偏好差异很大：pH 6 修不出来的抗原，换成 EDTA pH 9 常常就「起死回生」。建议在组里维护一张「抗体修复条件记录表」——每个抗体用过的修复液、修复方式、稀释度、结果好坏都记下来，后来的人少走无数弯路。
3. 染色流程与典型参数
- 脱蜡水化：二甲苯 2 次 × 5~10 分钟 → 无水乙醇 → 梯度酒精（95%、85%、75%）→ 蒸馏水。脱蜡不干净是后续「染不上」的常见原因。
- 灭活内源性酶（IHC）：3% H₂O₂ 室温 10 分钟左右，封闭组织内源性过氧化物酶（红细胞、粒细胞丰富组织尤其必要）。
- 封闭：5%~10% 正常血清（选择与二抗宿主无关种属的血清）或 3%~5% BSA，室温 30~60 分钟，甩掉即可（不用洗）。
- 一抗：按说明书稀释度（常见 1:100~1:1000 量级），4 ℃ 湿盒过夜。湿盒必须水平放置，防止抗体液「跑掉」造成边缘效应。
- 洗涤：PBS/TBS 洗 3 次 × 5 分钟。洗涤不充分 = 背景升高的第一大来源。
- 二抗：IHC 用 HRP 聚合物法二抗（灵敏度高于老式 PAP/ABC，且不含生物素，避免内源性生物素干扰）；IF 用对应的荧光二抗，室温 30~60 分钟、全程避光。
- IHC 显色：DAB 工作液滴加，镜下实时观察，阳性部位出现棕黄色即终止（典型 1~10 分钟，宁可欠一点不要过染）。随后苏木精复染 1~2 分钟，流水返蓝，梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
- IF 收尾：DAPI 染核约 5 分钟，抗淬灭封片剂封片，避光 4 ℃ 保存，尽快采图。
4. 对照意识：没有对照的染色不可解释
- 阴性对照：用 PBS 代替一抗（省略一抗），或用同型抗体替代——它显示的是背景与非特异结合水平。如果省略一抗的切片也「阳」了，你的阳性结果就不可信。
- 阳性对照：用已知表达该抗原的组织（说明书或文献会给参考组织）。阳性对照不阳，说明染色体系或抗体有问题，而非你的样品阴性。
- 一抗种属与二抗必须匹配：一抗兔源 → 抗兔二抗；一抗鼠源 → 抗鼠二抗。用错种属是最常见的「全军覆没」原因。
5. IF 多标与共定位注意
- 一抗种属要错开：双标 / 多标时，几种一抗必须来自不同宿主种属（如兔 + 鼠），二抗才能「认领」各自的一抗；做不到时用顺序染色试剂盒或直接标记一抗。
- 通道选择防串扰：两种荧光的发射谱要分得开（如绿 + 红、红 + 远红组合），并了解自己显微镜的滤光片组配置；merge 图上「看起来共定位」要先排除串色假象。
同一批实验的所有组别（对照、模型、给药……）在共聚焦 / 荧光显微镜上采图时，激光功率、增益（PMT/探测器）、针孔、曝光时间等参数必须完全一致，只允许在不同视野之间移动载物台。不同参数拍出的图放在一起比较荧光强度，等于没有可比性——这是 IF 定量最常见的翻车点。
常见问题排查表
| 现象 | 可能原因 | 解决办法 |
|---|---|---|
| 脱片（组织掉片） | 烤片不足；热修复过于剧烈；切片太厚或摊片不佳 | 延长烤片（如 60 ℃ 数小时至过夜）；换用防脱片（粘附）载玻片；优化修复条件与切片质量 |
| 背景高 / 非特异着色 | 封闭不足；抗体浓度过高；内源性色素 / 生物素干扰；洗涤不充分 | 延长封闭、换血清；降低一抗 / 二抗稀释度；IHC 加内源酶灭活、用聚合物法二抗；严格按 3×5 分钟洗涤 |
| 弱阳或无信号 | 抗原修复方式不合适；抗体不适用于 IHC/IF（仅验证过 WB）；一抗过稀；显色时间不足 | 换修复液（pH 6 ↔ pH 8~9）与修复方式；购买前必须查 datasheet 的「Applications」是否包含 IHC / ICC——WB 能用的抗体未必能做 IHC；滴定抗体浓度；延长 DAB 时间 |
| 组织自发荧光强 | 冰冻切片、固定过久的组织常见；红细胞 / 胶原等成分自发荧光 | 改用远红通道检测；使用自发荧光淬灭剂；优化固定时间；设无抗体对照评估自发荧光水平 |
| 边缘着色深 / 局部阴性 | 湿盒不平，抗体液聚集在边缘；切片局部干燥 | 保证湿盒水平、组织全程湿润不干片；抗体液均匀覆盖组织 |
结果怎么看
第一步看定位：信号出现在细胞膜、细胞质还是细胞核？定位本身就是生物学信息（比如转录因子该在核里，膜受体该在膜上），定位错了要么是抗体非特异，要么是细胞状态异常。第二步看分布：是全体细胞都阳，还是只有某一类细胞阳？配合 H.E. 形态一起读。第三步才是看强弱。
IHC 常用半定量评分，如 IRS 类体系：阳性细胞比例得分（0~4 分）× 着色强度得分（0~3 分）= 总分，由两人独立盲评更可靠。IF 的共定位看 merge 图：两种颜色叠加出的第三种颜色（如绿 + 红 = 黄）提示两种蛋白空间上共定位，定量可用共定位系数（如 Pearson 系数），但前提是串色已排除、各通道单染对照齐全。
严谨性红线（务必阅读）
- 同一实验各组的采图参数（激光功率、增益、曝光等）必须一致，不允许给某组「多拍一会儿」或调高增益；
- 不允许对单个组别的图像独立调整亮度 / 对比度——要调就全组同一参数统一处理，并在图注说明；
- 不允许只挑好看的视野：应事先规定取视野规则（如每张切片随机取若干个 200× 视野，避开坏死区与边缘），按规则采图；
- 原始图像文件（含标尺、通道、参数元数据）必须完整归档；
- 没有阴性 / 阳性对照的染色结果不可用于结论。
组内信息
- IHC / IF 暂不在当前细胞实验主线中，作为扩展技能备用；
- 抗体修复条件、切片机与共聚焦使用规矩：暂定，使用前单独培训。
学完之后
建议的下一步：拿组里验证过的抗体 + 已知阳性组织，完整跟做一次石蜡 IHC（重点观摩脱蜡、热修复和 DAB 镜下控时），再用细胞爬片做一次单标 IF 练习固定、通透与避光操作。两条线跑通后，再上自己的样本。细胞水平的实验入门请继续阅读 CCK-8 / MTT 教程。