RNA 提取（TRIzol 法）：组内标准流程
为什么 RNA 提取是 qPCR 的生命线
想回答「某个基因的表达变没变」，组里的标准路线是 qPCR。但 qPCR 的第一条引物还没合成之前，决定成败的其实是最前面那一步：RNA 提取。反转录和扩增都只是「忠实地放大」你给它的模板——模板本身又多又完整，后面的数据才可信；模板降解了、污染了，Ct 值再漂亮也是空中楼阁。所以组内常说：RNA 提取是 qPCR 的生命线，上游的一支枪头就能决定下游整张图。
RNA 比 DNA 脆弱得多：单链结构不稳定，而环境里的 RNase（核糖核酸酶）几乎无处不在——皮肤、唾液、灰尘里都有，而且极耐热，普通高压灭菌都未必能灭活。TRIzol 类试剂的设计思路正是针对这一点：用苯酚 + 异硫氰酸胍一步裂解细胞并原位灭活 RNase，再利用有机相与水相「互不相溶」的物理性质，把 RNA 从蛋白和 DNA 里分离出来。整个流程不需要昂贵仪器，一台 4 ℃ 高速离心机加一双手就能做，但每一步的体积、温度、时间都影响得率和纯度，本篇把组内标准参数逐一写清。
Trizol 裂解 → 氯仿抽提分层 → 吸上层水相 → 异丙醇把 RNA 沉淀下来 → 乙醇洗去盐和杂质 → 干燥后用 RNase-free water 溶解。全程大约 2~3 小时，离心时间占大头。
实验准备清单
RNA 实验的成败有一半在动手之前。开管之前先对照这份清单：
- 仪器：预冷 4 ℃ 离心机（转速至少 12000 rpm）——提前开机预冷，别等裂解完了才想起来；制冰机取冰，操作尽量冰上进行；
- 防护与习惯：戴口罩（防说话唾沫飞沫里的 RNase）、戴手套并勤换、长发扎起、操作时少说话；
- 耗材：RNase-free 枪头（带滤芯更佳）/ 1.5 mL EP 管，开封后专用，不与跑蛋白、质粒的器皿混用；
- RNA 专用试剂：Trizol 裂解液、氯仿、异丙醇、乙醇、RNase-free water——全部专用、专区存放，用完归位；
- 记号笔与记录本：每个 EP 管提前写好样品编号 + 日期，提取过程中的体积和异常情况随手记录。
Trizol（含苯酚与胍盐）和氯仿都有腐蚀性与挥发性，必须戴手套、在通风良好的位置操作，沾到皮肤立即大量清水冲洗；废液（有机相下清液）倒入指定废液瓶，不进下水道。
流程总览
分步详解与关键参数
1. 裂解：组织与细胞两条路
组织 RNA：组织离体后尽快操作（或液氮速冻后 -80 ℃ 保存），每 50~100 mg 组织加 1 mL Trizol 裂解。组织要先剪碎（冰上、快速），再用匀浆器充分研磨匀浆——匀浆不彻底是组织样品得率低的第一原因。
细胞 RNA：先用 PBS 洗涤 / 离心沉淀细胞，去掉培养基和血清（血清蛋白和成分会干扰分层），每 5~10×10⁶ 个细胞加 1 mL Trizol，反复用枪吹打或剧烈振荡裂解，直到看不到细胞团块、液体透亮均匀。
- 为什么比例不能错：Trizol 体积是按样品量反推的「容量上限」——组织太多或细胞太多，RNase 灭活不彻底、裂解不完全，降解和得率低会同时出现；
- 易错点：裂解后室温放置几分钟再进入下一步（让核蛋白复合物充分解离）；样品多的时候分批做，绝不允许裂解前的细胞/组织在室温「排队等待」。
2. 氯仿抽提：分层的关键一步
每 1 mL Trizol 加 0.2 mL 氯仿（1/5 体积），盖紧 EP 管（一定要盖紧，震荡时飞液既危险又损失样品），手中用力震荡 15 秒（约 10 次），放置 2~3 min，12000 rpm、4 ℃ 离心 15~20 min。离心后管内液体清晰分成三层：
- 为什么用力震荡：震荡让氯仿与裂解液充分接触，把蛋白、脂质、DNA「拽」进有机相和中间层——震荡不充分，分层不清，水相就脏；
- 为什么要 4 ℃ 高速离心：低温保护 RNA，12000 rpm 以上才能把三相压得界限分明；离心完从离心机取出时不要晃动，拿管动作轻，分层一晃就花了。
3. 沉淀 RNA：吸水相的手上功夫
用 200 μL 黄色枪头小心吸取上层水相至新 EP 管（杜绝吸到中间层 / 下层）。枪头贴着液面缓缓下移、缓缓吸取，快到中间层之前果断停手——宁可少吸一点水相，也不要贪多把下层带上来。水相不必吸干，损失一点体积换一个干净的水相，是划算的。
转移后加入等量异丙醇混匀，4 ℃ 静置 20 min，12000 rpm、4 ℃ 离心 15 min，管底会出现白色或透亮的微量沉淀，这就是 RNA。
- 为什么不能用蓝枪头吸：1000 μL 蓝枪头口径大、吸力猛，非常容易一次性把中间层吸上来（基因组 DNA 和蛋白污染的来源）；200 μL 黄枪头细、控制精细，是这一步的标准配置；
- 沉淀温度的说明：室温沉淀也可以，4 ℃ 效果更好；若做 RIP 实验则在 -80 ℃ 冰箱沉淀（低温长时间沉淀能回收片段更小、更稀的 RNA）；
- 易错点：离心后沉淀常常贴在管底侧壁，肉眼几乎看不见——弃上清前先在管壁做好记号，离心时把标记朝外，沉淀位置心里有数，倒液时才不会把 RNA 一起倒掉。
4. 乙醇洗涤：把杂质洗掉，把 RNA 留下
弃上清后加 75% 乙醇（1 倍体积，DEPC 水配制），移液器轻轻吹打混匀（不用把沉淀打碎），12000 rpm、4 ℃ 离心 20 min，弃上清。
- 为什么洗：残留的胍盐、苯酚、氯仿会抑制反转录和后续酶反应，也会拉低 A260/230；75% 乙醇既能溶解带走这些盐分和有机杂质，又不会把 RNA 溶掉；
- 为什么用 DEPC 水配制：DEPC 处理过的水无 RNase，普通水配的乙醇可能把 RNase「洗」进样品里；
- 易错点：洗涤离心后沉淀最容易松动，弃上清动作要轻、快，管口在吸水纸上蘸一下，不要把沉淀甩飞；必要可洗两次。
5. 干燥、溶解与保存
沉淀室温自然干燥（或超净台小风吹干，置于干净环境防灰尘），肉眼观察沉淀从湿亮变为哑光即可。用 RNase-free water 溶解（体积按下游用量定，常用 20~50 μL），轻弹管壁或低速短暂离心帮助溶解。RNA 易降解，-80 ℃ 储存，并尽量分装、避免反复冻融。
- 为什么干燥要适度：乙醇没挥发干净会抑制下游酶反应；但干燥过度（比如晾到发白开裂、放了几十分钟）RNA 会不可逆变性，溶解不下来，表现为「明明有沉淀，测浓度却极低」；
- 易错点：干燥时敞口放在超净台里无人看管、正对风口灰尘飘落，是常见的污染来源；溶解后尽早测浓度、尽早进入反转录，RNA 在手上每多放一小时都在折损。
样品多的时候排好「时间差」：趁第一批离心的时候给第二批加氯仿，流水线推进，全程不停手；每管写清编号，吸水相时一管一换枪头——枪头就是样品之间交叉污染和 RNase 传播的头号载体。
RNA 质控一句话
溶解后立刻取 1~2 μL 用 Nanodrop 测浓度与纯度：A260/280 ≈ 2.0 左右为佳（明显偏低提示蛋白 / 苯酚污染，即水相吸脏了），A260/230 偏低则多为胍盐 / 有机试剂残留（洗涤不充分）——具体的判读标准与完整质控清单见 qPCR 一篇的「RNA 质控」小节，质控合格后直接进入反转录。
常见问题排查表
| 现象 | 可能原因 | 预防与补救 |
|---|---|---|
| 得率低 / 浓度测不出 | 组织量过多导致裂解不彻底（超过每 100 mg 加 1 mL Trizol 的比例）；细胞数不够；吸水相时太保守、吸得过少；沉淀在弃上清时被倒掉 | 严格按 50~100 mg 组织 / 5~10×10⁶ 细胞对应 1 mL Trizol 的比例；组织充分匀浆；管壁标记沉淀位置；宁可重提，不要硬拿低浓度样品做下游 |
| RNA 降解（电泳弥散、28S/18S 不清） | RNase 污染：未戴口罩 / 手套、器皿或水源不专用；样品离体后未及时裂解；组织反复冻融 | 全程 RNase-free 专物专用；组织液氮速冻、避免反复冻融；裂解前的样品不排队；操作快、冰上做；降解样品只能重提 |
| A260/280 异常（偏低） | 吸到中间层 / 下层有机相，带入蛋白、DNA 与苯酚；洗涤不充分、乙醇残留 | 用 200 μL 黄枪头慢吸、留余量；必要时重复乙醇洗涤一次；彻底晾干后再溶解；污染严重的样品重新抽提一次比带着污染做下游更省时间 |
严谨红线（务必阅读）
- 参数不许事后补写：每个样品的取样量、Trizol / 氯仿 / 异丙醇体积、离心参数与时间、异常现象（吸到中间层、沉淀飞了、干燥过头）必须当场写进实验记录本，不可回家凭记忆补写；
- 编号一一对应：样品管编号、记录本编号、后续 Nanodrop 导出文件名三者一致，转录时抄错一个编号，整批数据对不上号；
- 失败要如实记录：得率低、污染、降解都写清楚原因分析，供同组避坑——「这管假装没提过」不是处理方式；
- Nanodrop 原始读数与质控判断结论（合格 / 不合格、是否重提）随样品一起归档。
组内信息
学完之后
建议路径：先跟师兄师姐完整做一批样品（重点看吸水相的手法和弃上清的动作），再用富余样品独立重复一次全流程，Nanodrop 读数稳定在合格区间后，才接自己的正式样品。提取合格后直接进入 qPCR 教程的反转录与上机部分；想知道蛋白层面的平行验证，再看 Western Blot 教程。